Untersuchung und Bewertung der Karzinogenese

Die Karzinogenese wird mit verschiedenen standardisierten toxikologischen Tests untersucht. Ein erster Teil dieser Tests wird in vitro durchgeführt, und wenn sie positiv sind, führen wir ein in vivo-Experiment durch. Dieser experimentelle Schritt-für-Schritt-Ansatz wird als DECISION POINT APPROACH bezeichnet, eine Abfolge von Versuchen, die am Ende jedes Versuchs anhalten, um zu entscheiden, wie mit dem Versuch fortgefahren werden soll. Es gibt fünf Stufen:

PHASE A: Struktur und Eigenschaften der krebserzeugenden Verbindung;

PHASEB: In dieser Phase der kurzfristigen In-vitro-Tests werden Säugerzellen verwendet. Die am häufigsten verwendeten Zellen sind Hepatozyten, da das Ausmaß der Reparatur des Schadens, den die Hepatozyten entwickeln, entsprechend der Schwere der durch die Substanz verursachten Schädigung untersucht wird. Kurz gesagt, wir bestimmen nicht den Schaden an sich, sondern wie viel des Reparatursystems von der Leberzelle aktiviert wurde.

Das implementierte Verfahren besteht darin, 3 Hepatozytenkulturen zu bilden. In der ersten Kultur sind die Hepatozyten gesund, in der zweiten werden sie mit der Prüfsubstanz und schließlich in der dritten mit einer sicher krebserregenden Kontrollsubstanz behandelt.Diese drei Kulturen enthalten eine radioaktive Pyrimidinbase, die tritiiertes Thymidin ist, das als Marker fungiert.

Verursacht die untersuchte Verbindung eine Mutation in der DNA, reagiert die Zelle auf dieses Problem mit der Aktivierung der Reparatursysteme. Das DNA-Stück, das die Mutation durchlaufen hat, wird geschnitten und dank der Wirkung der DNA-Polymerase wird das fehlende Stück durch ein neues ersetzt.Für die Korrektur verwendet die DNA-Polymerase die neuen Basen, einschließlich tritiiertem Thymidin. Eine radioaktive Base wird eingebaut. Die Analyse der Radioaktivität bestimmt den Grad der Mutation in den behandelten Zellen: Je höher die Radioaktivität, desto größer die DNA-Mutationen.

Auch in Phase B werden Tests an Bakterien durchgeführt, um zu untersuchen, ob Rückmutationen vorliegen. Bei den verwendeten Bakterien handelt es sich um Salmonellen, die bereits Mutationsträger sind. Die Mutation betrifft die Synthese von Histidin, sodass Salmonellen ohne Histidin nicht wachsen können. Diese Bakterienkolonien werden teils mit der Prüfsubstanz, teils für die Negativkontrolle und teils für die Positivkontrolle behandelt und dann mit einem bekannten Karzinogen getestet. Wenn diese Prüfsubstanz indirekt genotoxisch ist, müssen metabolisierende Enzyme in das Kulturmedium eingebracht werden. Zu diesem Zeitpunkt werden 3 Kulturen ausgesät und in Petrischalen gezüchtet (kein Histidin im Nährmedium) Wenn keine Mutationen des zu testenden Karzinogens aufgetreten sind, sollten theoretisch keine auf den Platten vorhanden sein Wenn das Karzinogen mutagen wirkt, kann es die erste Mutation verändert haben und eine zweite Mutation geschaffen haben, die die Bakterien auf dem histidinfreien Kulturmedium wachsen lässt. In diesem Fall die zweite Mutation, die die erste Mutation modifiziert und nimmt den Namen RETROMUTATION an Wenn schließlich ein signifikantes Wachstum in der Piasta Petri auftritt, ist das Karzinogen direkt.
Immer mit einem In-vitro-Test ist es möglich, die chromosomale Integrität zu bestimmen.Dieser Test wird immer an Säugerzellen durchgeführt und wird verwendet, um toxische Substanzen zu testen, die Mutationen an einigen Enzymen verursachen können, die für die Biosynthese der DNA verantwortlich sind wird einer in-vitro-Analyse unterzogen Um feststellen zu können, ob die untersuchte Substanz die Integrität und Anzahl der vorhandenen Chromosomen beeinflusst, wird der Mikronukleus-Test verwendet. Die Mikronuklei sind Vesikel, die mit einem Teil des Chromatins im Inneren gebildet werden.Das in diesen Mikronuklei eingebaute Chromatin kann entweder ganze Chromosomen oder Chromosomenfragmente sein.Die Mikronuklei werden durch falsche Zellteilung gebildet, wodurch Tochterzellen mit nicht gleichem Erbgut entstehen Das Ergebnis dieses Tests ist die Bestimmung von Substanzen, die als klastogen und Spindelgifte definiert sind. Die klastogene Substanz produziert Mikrokerne mit azentrischen Chromosomenfragmenten, so dass die Substanz einen Bruch in den Chromosomen induziert, stattdessen produziert die Giftsubstanz der Spindel die Mikrokerne, die darin enthalten sind ganze Chromosomen.
Wenn die untersuchte Substanz in einem oder mehreren Tests eine Genotoxizität induziert, wird diese als hochverdächtig definiert, also geht sie direkt in die Phase D. Wenn die getestete Substanz hingegen keine genotoxische Wirkung hat, geht sie in die Studienphase über C, weil es ein Promoter sein kann.

FASEC: In dieser Phase können sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Tests durchgeführt werden.

Für In-vitro-Tests konnte die Möglichkeit der Promotorsubstanz gezeigt werden, die Gap-Junctions zwischen normalen Zellen und Tumorzellen zu durchbrechen, wodurch Substanzen zwischen den beiden Zellen transportiert werden können.

Ein In-vivo-Test ist die Induktion von Hauttumoren bei Mäusen. Die zu testende Substanz wird zwei- bis dreimal pro Woche auf die Haut der Maus aufgetragen. Innerhalb von 2/3 Monaten kann es zu Papillombildungen kommen, wenn diese Substanz ein Promotor ist. Bei Mäusen werden zwei Hauptdaten berücksichtigt: die Anzahl der von Papillomen befallenen Mäuse und die Anzahl der bei jedem Tier vorhandenen Papillome. Wirkt die Substanz als Promotor und entwickelt in der behandelten Maus einen Tumor, bedeutet dies, dass es sich tatsächlich um eine Substanz mit Promotorwirkung handelt.

Sobald diese Tests abgeschlossen sind, gehen wir zu langfristigen In-vivo-Tests über.

FASED: In dieser Phase werden alle Verbindungen getestet, die sich als mutagen erweisen und alle Verbindungen, die sich nicht als mutagen erweisen. Es können verschiedene Tests durchgeführt werden, von denen einige Tests an der Leber, an der Lunge und schließlich an der Brust durchgeführt werden.

Der Lebertest zeigt die Bildung nicht eines neugebildeten Tumors, sondern eines neoplastischen Herdes, also etwas, das sich darauf vorbereitet, ein Tumor zu werden. Die Zellen dieses Fokus sind bereits atypische Zellen, haben also eine Mutation durchlaufen und bereiten sich darauf vor, neoplastische Zellen zu werden. Nach einer gewissen Zeit wird dank der Obduktionsuntersuchung die Bildung präneoplastischer Herde festgestellt, indem Anzahl und Ausmaß dieser präneoplastischen Bildungen berechnet werden.

Der Lungentest ermöglicht die Bestimmung eines Adenoms, das ist eine „Anomalie der Zellen des Lungengewebes. Auch hier wird das Lungengewebe der Ratte nach längerer Zeit (Monaten) untersucht (diese Adenome sind leicht zu erkennen, weil sind weißliche Knötchen auf dem Lungenepithel).
Der Brusttest ermöglicht die Bestimmung von Tumoren im Drüsengewebe. Es werden immer die Anzahl der gebildeten Adenome und die Anzahl der Tiere mit Adenomen ausgewertet.

Bei positiven Ergebnissen dieser Tests ist die Testsubstanz wirklich krebserregend. An dieser Stelle gehen wir dazu über, teure Tests mit sehr langen Ausführungszeiten durchzuführen.

PHASEE: In dieser Phase wird eine variable Anzahl von Tieren zwischen 20 und 50 Langzeittests unterzogen, die sehr teuer sind und lange dauern, bis bestimmte Ergebnisse erzielt werden; wir sprechen von etwa 1/8 des Lebens des Tieres Es ist möglich, dass einige Tiere während dieser Tests sterben, aber sie werden immer mit einer Autopsie und einer histologischen Typuntersuchung untersucht. Die ausgewählten Tiere sind immer Ratten und Mäuse und nur 70-80% überleben bis zum Ende der Langzeittests. Die verwendeten Tiere werden gerade entwöhnt, denn je jünger sie sind, desto empfindlicher reagieren sie auf Behandlungen. Während der Langzeittestphase wird der Forscher immer von einem Mathematiker-Statistiker unterstützt, der in der Lage ist, alle gesammelten Informationen zu berücksichtigen und die verschiedenen Daten zu reproduzieren.

Die an Tieren getesteten Dosen beginnen mit der maximal tolerierten Dosis und allen ihren Teilmengen, und die Dosis-Wirkungs-Reaktion im Tier wird bewertet.
Die Verabreichung muss immer auf dem Weg erfolgen, über den der Mann mit der untersuchten Substanz in Kontakt kommen kann, also den oralen, kutanen oder respiratorischen Weg, während bei der Prüfung der Karzinogenität eines Arzneimittels auch eine intravenöse Verabreichung sinnvoll ist.
Die getesteten Tiergruppen sind 4 (50 Tiere für jede Gruppe):

Eine NAIF-Gruppe, die keine Behandlung hat;
Eine Gruppe, die mit dem Vehikel behandelt wurde;
Eine Gruppe, die mit der Testsubstanz behandelt wurde;
Eine Gruppe, die mit einem bekannten Karzinogen behandelt wurde.

Es ist sehr wichtig, dass die Anzahl der Tiere in jeder Gruppe möglichst gleich ist, denn wenn die Anzahl der Tiere zu groß ist, kann sich der statistische Test als falsch erweisen.
Die durchgeführten Auswertungen sind:

Gesamthäufigkeit von Tumoren;
Häufigkeit einiger Tumoren;
Häufigkeit von Tieren mit mehr als einer Tumorart;
Zahl der Tierkrebserkrankungen.

Am Ende all dieser Studienphasen wird der Stoff in ein Ranking der IARC (International Agency for Research and Development on Cancer) und der Environmental Protection Agency (EPA) eingeordnet.